Индивидуальные особенности фармакокинетики флударабина фосфата при лечении пациентов с хроническим лимфолейкозом

Введение / Introduction

Универсальный механизм метаболизма лекарственного средства в каждом конкретном случае реализуется в зависимости от функционального статуса организма, который в свою очередь определяется особенностями его гено- и фенотипа.

Несомненно, велико значение генетических полиморфизмов ферментов метаболизма ксенобиотиков в формировании индивидуального ответа на фармакотерапию. Эти генетические факторы представляют собой полиморфные участки генов, которые обусловливают особенности белкового синтеза, определяющего через ферментативную систему фармакодинамику и фармакокинетику [1—5].

Персонализация лекарственной терапии с помощью генотипирования на практике не оправдала надежд [6]. Это обусловлено тем, что в процессе жизни наслаивается приобретаемый динамичный детоксикационный потенциал ко всем ксенобиотикам, в том числе лекарственным средствам. На первый план выступает индивидуальный фенотип метаболизма, который в каждый конкретный момент зависит от множества факторов, предсказать и учесть которые практически невозможно. В первую очередь реакция на действие лекарственного препарата зависит от функционального состояния органов, отвечающих за метаболизм и элиминацию — печень, почки, кишечник.

Также широко известно, что фармакологический ответ в ходе применения лекарственных препаратов у различных больных неодинаков и зависит от антропометрических характеристик, образа жизни, характера питания, сопутствующих заболеваний [7][8].

Таким образом, индивидуальный фармакодинамический профиль конкретного лекарственного соединения оказывает существенное влияние на эффективность проводимой терапии, что вызывает необходимость персонифицированного подхода к режиму его дозирования и введения [9]. Особенно это актуально для лекарственных средств с узким терапевтическим диапазоном и при тех заболеваниях, от эффективности терапии которых зависит жизнь пациента. Прежде всего это касается онкологической патологии.

В последние годы в лечении лимфопролиферативных заболеваний достигнуты определённые успехи благодаря введению в стандарты терапии новых химиопрепаратов. Один из них: флударабин — цитостатик, имеющий благоприятный профиль безопасности и переносимости.

Флударабин (F-ara-A) представляет собой пуриновый аналог, обычно используемый для лечения В-клеточных злокачественных новообразований, который влияет на различные этапы синтеза ДНК и РНК.

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния на модельные параметры фармакокинетики индивидуальных характеристик пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом при стандартном курсе лечения препаратом МНН флударабин.

Материалы и методы / Material and methods

Настоящее исследование проводилось в соответствии с международными стандартами, а также в соответствии с этическими принципами, изложенными в Хельсинской декларации [10]. В исследование было включено 36 пациентов обоего пола с В-клеточным хроническим лимфолейкозом в возрасте от 45 до 65 лет включительно. Диагноз В-клеточного хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) установлен согласно рекомендациям рабочей группы NCI (англ. National Cancer Institute) [11]. Установленный диагноз В-клеточного ХЛЛ был подтверждён результатами биопсии костного мозга и иммунофенотипирования, давностью не более 3 месяцев, на стадии А или В по классификации Binet, требующий лечения. Балл по шкале ECOG составил 0—2. Клинические ковариаты для стандартного пациента были основаны на средней оценке дозы, рассчитанной по площади поверхности тела (ППТ) в соответствии с клиническими рекомендациями. Так как флударабин вводился в виде монофосфатной формы, основанная на модели доза F-ara-A была умножена в 1,28 раза для преобразования в эквивалентные дозы F-ara-AMP (на основе соотношения молекулярных масс) [12].

Все пациенты получали препарат c МНН флударабин в дозе 40 мг/м² один раз в день перорально в течение 5 дней подряд натощак. Дозы исследуемого препарата были рассчитаны исходя из количества миллиграммов флударабина фосфата на квадратный метр ППТ, измеренной перед назначением исследуемого препарата (мг/м²). ППТ пациента была вычислена согласно методу Mosteller: ППТ (м²) = V (рост пациента (см) × масса тела (МТ) (кг))/3600. Выбранная доза препарата и продолжительность курса лечения пациентов полностью соответствовали утверждённой инструкции по медицинскому применению [13].

Согласно исследованиям фармакокинетики и фармакодинамики, в организме человека флударабин быстро и полностью дефосфорилируется до активного метаболита — нуклеозида 2-фтор-арабинофуранозиладенин (2-фтор-ара-А). После приёма внутрь флударабина максимальные уровни 2-фтор-ара-А в плазме достигаются через 1—2 часа. Средняя биодоступность 2-фтор-ара-А находится в пределах 50—65 %. Терминальный период полувыведения 2-фтор-ара-А составляет примерно 20 часов [14][15].

Забор образцов крови для определения концентрации 2-фтор-ара-А (основного метаболита флударабина) в первый день приёма препарата производился непосредственно перед приёмом и спустя 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1, 1½, 2, 3, 4, 6, 8, 10 и 24 часа после приёма. Забор образцов крови производился в подписанные 5 мл пробирки c антикоагулянтом (ЭДТА, этилендиаминтетраацетат), предназначенным для получения плазмы крови. Плазму немедленно отделяли центрифугированием при 10 ºС, 2500 оборотах в течение 15 минут.

Для изучения индивидуальных показателей фармакокинетики у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом при стандартном курсе лечения препаратом с международным непатентованным наименованием (МНН) флударабин был разработан и валидирован в соответствии с требованиями Европейского экономического сообщества (ЕЭС) и Европейского агентства лекарственных средств (англ. European Medicines Agency; EMA) хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения в плазме крови 2-фтор-ара-А — активного метаболита флударабина фосфата [4, 16]. В качестве основы для разработки метода взяты данные публикаций [17][18]. Методика реализована на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Agilent 1200» с тройным квадруполем «Agilent 6460», США. Валидация методики включала: линейность метода; установление пределов количественного определения; точность и достоверность внутри аналитической серии; точность и достоверность между аналитическими сериями; селективность; стабильность аналита. Линейный диапазон метода составил — 2,5—500 нг/мл, R^2>0,99. 2-фтор-ара-А экстрагировали из образцов плазмы крови объёмом 200 мкл путём осаждения белков ацетонитрилом, содержащим 0,1 % муравьиной кислоты. В качестве внутреннего стандарта использовался кладрибин. Разделение осуществлялось на аналитической колонке Zorbax Eclipse Plus C18 Analytical 250 мм × 4,6 мм × 5 мкм в изократическом режиме со скоростью потока 0,5 мл/мин. В качестве элюента использовалась смесь ацетонитрила и воды, содержащей 0,1 % муравьиной кислоты в соотношении 1:3. Использовали систему ионизаций электроспрей в положительной полярности (ESI +) и мониторинг множественных реакций (MRM). Для количественного определения выбраны ионные пары 286,1/154,1 для 2-фтор-ара-А и 286,1/170,0 для внутреннего стандарта. Время удержания 2-фтор-ара-А составляло 5,03 мин. Общее время анализа — 6,5 минут. Используемый простой способ осаждения белков при приготовлении образцов и быстрое хроматографическое разделение аналита и эндогенных компонентов плазмы крови показал приемлемый результат без каких-либо значимых эффектов наложения. Воспроизводимость, прецизионность и правильность достигалась во всём интервале концентраций. Аналит оставался стабильным как при краткосрочном, так и при долгосрочном хранении. Отклонения результатов анализа образцов, прошедших 3 цикла заморозки и разморозки, от свежеприготовленных образцов не превышали 15 %. Готовые к анализу образцы плазмы с добавлением оставались стабильны после 24 часов хранения в автосамплере при комнатной температуре.

Математико-статистический анализ результатов осуществляли с использованием пакетов Microsoft Excel 2013, STATISTICA 10.0 и программы PKSolver [19].

Фармакокинетические параметры (ФКП) рассчитывали с применением модельно-независимого подхода [20], а также использовали одно- и двухкамерных моделей, построенных с применением программы PKSolver.

Для оценки возможной связи индивидуальных особенностей исследуемых лиц (антропометрических факторов) с ФКП использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (для количественных переменных) и точечно-бисериальный коэффициент корреляции (взаимосвязь дихотомических переменных (гендерной принадлежности) и ФКП).

Эффекты взаимодействия антропометрических факторов и их возможное влияние на ФКП оценивали с использованием модуля GLM (Общие линейные модели) программы STATISTICA 10.0

Результаты / Results

Результаты измерения концентрации 2-фторара-А в плазме крови пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом при однократном приёме перорально препарата с МНН флударабин в дозе 40 мг/м² представлена на рис. 1.

Отмеченные на рис. 1 значительные стандартные отклонения концентрации 2-фтор-ара-А во всех временных точках забора крови свидетельствуют о его значительной индивидуальной вариабельности. Это подтверждается статистическими показателями, приведёнными в табл. 1.

Приведённые в табл. 1 статистические данные убедительно показывают вариабельность откликов организма отдельных пациентов на одинаковую дозу принимаемого препарата. Разброс крайних значений, приведённый в последней строке таблицы по всем показателям фармакокинетической кривой и графически отражённый на рис. 2, даёт основание для вывода о необходимости использования индивидуального подбора эффективной дозы.

Обращает на себя внимание, что через 24 ч после однократного приёма препарата с МНН флударабин в дозе 40 мг/м² максимальная концентрация 2-фтор-ара-А в плазме крови разных пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом составляла 92,9 нг/мл, а минимальная — 10,3 нг/мл, т. е. различалась в 9 раз. С учётом того, что продолжительность курса лечения пациентов составляет 5 дней, последующий приём препарата будет наслаиваться на остаточную его дозировку от предыдущего приёма, а значит, индивидуальные различия в концентрации 2-фтор-ара-А в плазме крови пациентов будут только увеличиваться.

Принимая во внимание возможное влияние антропометрических характеристик пациентов на индивидуальный фармакокинетический профиль, проводили анализ их взаимосвязи с применением корреляционного анализа. В качестве основных индивидуальных показателей использовали пол и возраст, т. к. дозирование препарата с учётом площади тела априори учитывало рост и массу тела (МТ) пациентов.

Анализ корреллограммы основных ФКП и гендерно-возрастных переменных (рис. 3) показал, что прямая, статистически значимая (р≤0,05) корреляционная связь высокой тесноты по шкале Чеддока (r_s равен 0,814) отмечена только между фармакокинетическими показателями C_max и AUC_0-∞. Между возрастными данными и C_max, AUC_0-∞ также установлены прямые статистически значимые связи (р≤0,05), однако сила связи по шкале Чеддока отнесена к категории «умеренная» (от 0,3 до 0,5). Между гендерно-возрастными переменными и периодом полувыведения, а также другими ФКП, не представленными на рис. 3, статистически значимых выраженных связей установлено не было.

Приведённые на рис. 3 данные свидетельствовали о том, что анализируемые параметры зависели от фенотипических особенностей организма, включающих антропометрических характеристики пациентов, которые целесообразно учитывать при дозировании. Однако уровень взаимосвязи отдельных признаков выражен незначительно, что требует комплексного учёта влияния гендерно-антропометрических переменных.

Для оценки возможного влияния на ФКП как отдельных показателей (факторов), характеризующих пациентов на организменном уровне, так и их взаимодействия применяли модуль GLM (Общие линейные модели) программы STATISTICA 10.0. Модуль GLM предоставляет различные модели для анализа планов дисперсионного анализа с непрерывными и категориальными предикторами. В качестве зависимых переменных выступали отдельные ФКП, в качестве категориального предиктора — пол, в качестве непрерывных предикторов — возраст и масса тела.

Результаты факторного дисперсионного анализа с использованием модуля GLM показали (табл. 2), что ни один из анализируемых факторов, а также их взаимодействие не оказали статистически значимого влияния на уровень AUC_0-∞.

Аналогичные результаты были получены в отношении значительной части изучаемых ФКП — AUC_0-t, C_max, T_1/2 и K_el. Однако на часть показателей, рассчитываемых с использованием модельно-независимого метода — MRT (среднее время удержания препарата в крови), Cl/F (общий клиренс без учёта абсолютной биодоступности (F)), C_max/AUC_0-t (показатель относительной скорости всасывания) — анализируемые факторы оказали статистически значимое воздействие (табл. 3—5).

Представленные в таблицах 3—5 данные подтверждали гипотезу, высказанную по результатам проведения корреляционного анализа, о необходимости учёта гендерно-антропометрических признаков пациентов, включая их взаимодействие, при назначении и корректировке дозировки препарата с МНН флударабин.

Целесообразность персонифицированного подхода к режиму дозирования и введения определяет как необходимость проведения терапевтического лекарственного мониторинга (ТЛМ), так и, в качестве альтернативы, применение математического моделирования параметров фармакокинетики.

К известным примерам фармакокинетического моделирования относится применение медицинских калькуляторов [21]. Часто в качестве основы при математическом моделировании лекарственных препаратов с узким терапевтическим диапазоном используют однокамерную модель [22].

Для решения задач настоящей работы на основе данных о концентрации 2-фтор-ара-А в плазме крови пациентов были получены одно- и двухкамерные модели. В качестве показателей качества построенной модели использовали коэффициент детерминации (R²), представляющий долю дисперсии зависимой переменной (концентрации), объясняемой рассматриваемой моделью, и среднеквадратическую ошибку модели (MSE), которая представляет собой отклонения экспериментальных данных от полученных в ходе оптимизации теоретических кривых. Полученные результаты сравнительной оценки свидетельствовали о более высоком качестве двухкамерной модели как в целом (табл. 6), так и, в частности, на терминальном участке фармакокинетической кривой (рис. 4). Согласно приведённым раннее данным, терминальный период полувыведения 2-фтор-ара-А составляет примерно 20 часов [16, 17]. В настоящем исследовании усреднённые значения представленного показателя составили для бескамерной, одно- и двухкамерных моделей, соответственно, 12,2; 3,5 и 19,0 ч.

Результаты анализа взаимосвязей индивидуальных ФКП и возможностей их аппроксимации свидетельствовали о том, что для корректировки терапии необходим как учёт клинико-физиологических особенностей пациентов, так и применение математических моделей фармакокинетики. Для случая перорального приёма препарата с МНН флударабин в дозе 40 мг/м² в качестве основы целесообразно использовать двухкамерную модель.

Обсуждение / Discussion

Как правило, для определённого лекарственного препарата или его активного метаболита имеется субстратная специфичность, которая обусловлена генои фенотипом организма пациента, индивидуальную активность которых можно оценить лабораторными методами. В результате на основании оценки в динамике концентрации конкретного метаболита в плазме крови пациента формируется индивидуальная фармакокинетика лекарственного препарата [2].

Сложная система кинетики лекарственного препарата зависит от генотипических и фенотипических особенностей конкретного человека, которые необходимо учитывать при реализации одного из основополагающих принципов персональной медицины: «подходящая доза подходящего лекарства для данного пациента». Внедрение принципов персонализированной медицины естественно направлено на повышение качества лечения [23]. Для приемлемой клинической аппроксимации с целью индивидуального выбора дозировки целесообразно использование фармакокинетических моделей, позволяющих, в отличие от бескамерного подхода, количественно оценивать все основные этапы метаболизма лекарственного препарата [24].

Проведённое нами исследование, изложенное в данной статье, убедительно показывает необходимость индивидуального подбора эффективной дозы лечения. В нашем случае даже учёт площади поверхности тела пациента при расчёте необходимой дозы препарата не ликвидировал значительные индивидуальные различия метаболического профиля медикаментозной субстанции. Это входит в некоторое противоречие с постулированными стандартными схемами лечения препаратами, особенно с узким терапевтическим диапазоном.

Использованная в исследовании аналитическая технология высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием позволяет адекватно оценить индивидуальный метаболический фенотип и реализовать на практике концепцию фармакометаболомики персональной лекарственной терапии, сформулированной авторами [25].

Выводы / Conclusion

1. Разработанная и валидированная методика количественного определения концентрации 2-фтор-ара-А — активного метаболита флударабин фосфата в плазме крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием — позволила достичь цели исследования.

2. Установлена значительная индивидуальная вариабельность основных фармакокинетических показателей при однократном приёме перорально препарата с МНН флударабин в дозе 40 мг/м², так коэффициент вариабельности C_max составил 42 %, T_max — 92 %, AUC_0-t — 45 %, K_el — 23 %, T_1/2 — 26 %. Через 24 ч после приёма исследуемого препарата максимальная и минимальная концентрации в плазме крови метаболита флударабина 2 у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом различалась в 9 раз.

3. Индивидуальная вариабельность отдельных фармакокинетических параметров, в частности, характеризующих всасывание (C_max/AUC_0-t) и общий клиренс активного метаболита флударабина, статистически значимо связана с сочетанием гендерно-антропометрических факторов.

4. При пероральном приёме препарата с МНН флударабин в дозе 40 мг/м² концентрация 2-фторара-А в плазме крови пациентов достаточно адекватно аппроксимируется двухкамерной фармакокинетической моделью.

5. Подбор индивидуального курса терапии пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом препаратом с МНН флударабин целесообразно осуществлять на основании учёта гендерно-антропометрических характеристик и математического моделирования показателей фармакокинетики активного метаболита флударабин фосфата.