ЛПС-связывающие системы и эндотелиальная синтаза оксида азота у больных подагрой

Введение

Подагра — одна из наиболее распространённых воспалительных артропатий; она характеризуется отложением кристаллов моноурата натрия в тканях суставов [1, 2]. Ключевой фактор развития подагры — гиперурикемия (повышенный уровень мочевой кислоты в крови и активность ксантиноксидазы) [3]. Мочевая кислота является мощным антиоксидантом вне клетки, однако при высоких внутриклеточных концентрациях приобретает прооксидантные свойства, способствуя окислительному стрессу [4-6]. Таким образом, избыток мочевой кислоты способствует окислительному стрессу, воспалению и эндотелиальной дисфункции [3]. Важную роль в сосудистой функции играет эндотелиальная NO-синтаза (eNOS, NOS3), продуцирующая оксид азота (NO). NO регулирует сосудистый тонус, тормозит агрегацию тромбоцитов и адгезию лейкоцитов [3]. При повышении уровня мочевой кислоты активность eNOS снижается — это проявляется уменьшением связывания eNOS с кальмодулином и снижением выработки NO [5]. Таким образом, при подагре нарушение функции eNOS может усугублять сосудистые и противовоспалительные механизмы. Липополисахарид-связывающий белок (ЛСБ) является белком острой фазы, который участвует в иммунных ответах, вызываемых компонентами клеточной стенки бактерий [6]. Нарушение кишечного барьера и изменение микробиоты кишечника могут увеличивать риск бактериальной транслокации и хронического воспаления, что, как предполагается, связано с повышением ЛСБ [6, 7]. Повышенный уровень ЛСБ в плазме связан с хроническим воспалением и метаболическим синдромом [6, 7]. У пациентов с метаболическим синдромом и уже существующими сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также у пациентов с ожирением, отмечаются более высокие уровни ЛСБ [6].
Белок BPI (bactericidal/permeability-increasing protein) — компонент врождённого иммунитета, обладающий антибактериальной и противовоспалительной активностью. BPI (55 кДа) способен элиминировать грамотрицательные бактерии и нейтрализовать эндотоксин (ЛПС) [8]. В экспериментальных моделях было показано, что BPI существенно снижает воспалительный ответ при артрите: например, у мышей с индуцированным моноуратами артритом введение BPI снижало инфильтрацию лейкоцитов и продукцию цитокинов [2]. На основании этих данных мы выдвинули гипотезу, что BPI (или семейство BPI) может оказывать протективный эффект при подагре, уменьшая транслокацию ЛПС и частично нейтрализуя окислительный стресс, связанный с ксантиноксидазой и мочевой кислотой. В этом контексте, роль эндогенных противовоспалительных белков, таких как BPI, в модуляции функции эндотелия при подагре остается неизученной.

Цель исследования

Изучить взаимосвязь между уровнем BPI и концентрацией эндотелиальной NO-синтазы (NOS3) у пациентов с подагрой.

Материалы и методы

В исследование был включён 41 пациент с подтверждённым диагнозом «подагра» согласно критериям классификации EULAR/ACR 2015 г., и 33 человека контрольной группы, сопоставимых по возрасту и полу. Распределение по возрасту не соответствовало нормальному, поэтому количественные данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха Me [Q1; Q3]. Медиана возраста пациентов составила 60 лет [52,5; 65,2], у контрольной группы — 52 года [45; 59] (p=0,41). Критериями исключения стали: возраст <18 лет; острые инфекционные, аутоиммунные или онкологические заболевания; хроническая болезнь почек стадий 4–5; острые и хронические заболевания желудочно-кишечного тракта; прием антибиотиков или пробиотиков менее чем за месяц до начала исследования; беременность; отказ от участия; наследственная подагра. Все участники подписали информированное согласие. Исследование проведено согласно хельсинкской декларации всемирной медицинской организации 1964 года, устанавливающей этические принципы проведения медицинских исследований с участием человека, включая сбор и использование данных и биологического материала. Протокол исследования одобрен № 6 заседанием Комитета по биомедицинской этике ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» от 04.09.2025.

Рис. 1. Блок-схема потока пациентов (STROBE)

Блок-схема отражает поток участников исследования (рис. 1). Всего в анализ вошли 74 человека: 41 пациент с подтверждённой подагрой (по критериям EULAR/ACR 2015) и 33 человека контрольной группы. Все включённые пациенты завершили исследование и вошли в финальный анализ. Потерь при наблюдении не было.

Дополнительно исследуемая группа была разделена на подгруппы:

• Артериальная гипертензия (АГ) — где Группа 0 — это без заболевания, Группа 1 — наличие заболевания артериальная гипертензия.
• Сахарный диабет 2-го типа (СД 2 типа) — где Группа 0 — это без заболевания, Группа 1 — наличие сахарного диабета 2-го типа.

Уровни биомаркеров ЛСБ, BPI и NOS3 сравнили, чтобы исключить влияние этих заболеваний на уровни биомаркеров.

Венозную кровь забирали у пациентов в условиях стационара ревматологического отделения ГБУЗ РК «РКБ им. Н.А. Семашко» и центрифугировали (3000 об/мин, 10 мин). В плазме измеряли концентрации: ЛСБ, NOS3 (eNOS), BPI методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (производства Cloud-Clone corp., Китай) с помощью оборудования: микропланшетный ридер Synergy H1 производства BioTek. Количественные данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха: Me [Q1; Q3], где Me — медиана, Q1 — первый квартиль (25-й перцентиль), Q3 — третий квартиль (75-й перцентиль). Для оценки связи между уровнями BPI и NOS3 применяли линейную регрессию и рассчитали коэффициент корреляции Пирсона (r), коэффициент детерминации (R²) и уровень значимости (p). Анализ различий между группами по уровню BPI и NOS3 выполняли с использованием U‑критерия Манна-Уитни. Использовалось программное обеспечение IBM SPSS Statistics 26. Расчёт минимального объёма выборки проведён до начала исследования. Исходя из ожидаемого коэффициента корреляции Пирсона r = 0,5 при уровне значимости α = 0,05 (двусторонний) и мощности 80%, минимально необходимый размер выборки составил 29 человек в группе. Фактический размер выборки (n = 41 в группе пациентов с подагрой и n = 33 в контрольной группе) превышает расчётный минимум и обеспечивает достаточную статистическую мощность для выявления корреляции указанной величины.

Результаты

Уровень ЛСБ и высокочувствительного СРБ был статистически значимо выше у пациентов с подагрой по сравнению с контролем (p <0,001), что может говорить о системной активации воспалительного ответа, также, возможно, связано с усилением транслокации кишечного эндотоксина (липополисахарида грамотрицательной флоры) в лимфу и портальную кровь. Также в основной группе больных подагрой отмечались более низкий уровень BPI (p <0,001), что может свидетельствовать о дисбалансе эндотоксинлимитирующих систем в условиях хронического окислительного стресса на фоне высокой концентрации мочевой кислоты, эти факторы, вероятно, «истощают» запасы BPI. Мужчины преобладали как в основной (78%), так и в контрольной группе (73%), различий не выявлено (p=0,62).

Таблица 1

Характеристики пациентов и контрольной группы

Проведён регрессионный анализ, который показал положительную корреляцию между уровнями BPI и NOS3. Наблюдаемая зависимость описывается уравнением:

YₑNOS = 0,148 + 0,022 × X_BPI

При увеличении концентрации BPI на 1 пг/мл ожидается прирост NOS3 примерно на 0,022 нг/мл. Коэффициент корреляции составил r = 0,605, что по шкале Чеддока соответствует значительной тесноте связи. Уровень значимости составил (p <0,001), т. е. связь статистически достоверна. Коэффициент детерминации R² = 0,366 указывает, что около 36,6% дисперсии уровня NOS3 объясняется изменениями концентрации BPI. Следует отметить, что концентрация NOS3 в плазме не достигла статистически значимых различий между группами (медиана 0,28 [0; 3,125] нг/мл у пациентов с подагрой против 0,046 [0,01; 0,1] нг/мл в контрольной группе; p = 0,924), то есть абсолютные уровни NOS3 не различаются между сравниваемыми группами. Однако выявленная значимая положительная корреляция между BPI и NOS3 внутри группы пациентов с подагрой (r = 0,605; 95% ДИ: 0,365–0,769; p < 0,001) свидетельствует о наличии взаимосвязи между этими маркерами на индивидуальном уровне в условиях хронического воспаления, независимо от абсолютных концентраций.

При сравнении уровней биомаркеров ЛСБ, BPI и NOS3 между группами пациентов с наличием и отсутствием АГ и СД 2 типа получились следующие результаты (табл. 2). Для большинства сравниваемых пар значимых статистических различий не выявлено (p >0,05). Для ЛСБ отмечена тенденция к более высоким уровням у пациентов с АГ по сравнению с пациентами без АГ (медианы 14,35 и 11,45 соответственно; p=0,066), однако уровень значимости не достиг порога. По остальным биомаркерам различия между группами по АГ и СД 2 типу отсутствуют (p варьируют от 0,15 до 0,53). Таким образом, на данной выборке ассоциаций между исследуемыми биомаркерами и наличием АГ или СД 2 типа не обнаружено.

Таблица 2

Расчёт критерия Манна-Уитни между биомаркерами и подгруппами Сахарного диабета 2 типа. Где (группа 0) — это отсутствие заболевания, (группа 1) — наличие заболевания

Таблица 3

Расчёт критерия Манна-Уитни между биомаркерами и подгруппами Артериальной гипертензии. Где (группа 0) — это отсутствие заболевания, (группа 1) — наличие заболевания

Обсуждение

Впервые в данном исследовании выявлена значимая положительная корреляция между уровнями BPI и NOS3 у пациентов с подагрой, что представляет особый клинический интерес. Данная ассоциация отражает сложное взаимодействие между системами врождённого иммунитета и эндотелиальной функции в патогенезе подагры. BPI, как ключевой компонент антибактериального ответа, и NOS3, регулирующий сосудистый тонус и эндотелиальную функцию, формируют интегральную ось, отражающую степень сосудистого воспаления и дисфункции эндотелия. Клиническая значимость выявленной корреляции BPI-NOS3 заключается в перспективах использования этих биомаркеров для комплексной оценки сосудистых осложнений при подагре. Комбинированное определение BPI и NOS3 может служить основой для индивидуализации терапевтических подходов, позволяя выделить пациентов с высоким риском развития сердечно-сосудистых осложнений. Более того, данная биомаркерная панель открывает возможности для мониторинга раннего сосудистого повреждения, что критически важно для своевременной коррекции терапии и предотвращения прогрессирования атеросклеротических изменений.

Защитный сосудистый эффект BPI может реализовываться через его противовоспалительное действие, включающее связывание и инактивацию липополисахарида (ЛПС) в крови, а также антагонистический эффект по отношению к липополисахарид-связывающему белку (ЛСБ) [9–11]. В литературных источниках указано, что BPI способен снижать секрецию IL-8 эпителиальными клетками, инфицированными E. coli; кроме того, противовоспалительный эффект BPI может реализоваться через инактивацию внутриклеточного воспалительного каскада при взаимодействии комплекса эндотоксин + ЛСБ с CD14/TLR4-рецепторами на клетках моноцитарно-макрофагального ряда [12]. Следует также учитывать, что BPI относится к семейству BPI-подобных белков, которые участвуют в метаболизме липидов и патогенезе некоторых сердечно-сосудистых заболеваний [9]. Специфический изомер BPIFB4 (bactericidal/permeability-increasing fold-containing family B member 4), особенно вариант, ассоциированный с долголетием (LAV-BPIFB4), оказывает значительное влияние на эндотелий и активность eNOS [13]. LAV-BPIFB4 фосфорилируется по остатку Ser75, после чего связывается с белками 14-3-3 и Hsp90, образуя комплекс BPIFB4–HSP90–14-3-3, что способствует активации eNOS (в частности, через фосфорилирование eNOS по Ser1177) [13]. Этот комплекс индуцирует фосфорилирование eNOS по Ser1177, что приводит к выработке оксида азота (NO) в эндотелиальных клетках [13]. Классическая активация NOS3 требует наличия внеклеточного Ca²⁺, однако существуют и альтернативные пути: например, BPI может способствовать вазорелаксации, опосредованной эндотелиальным гиперполяризующим фактором (EDHF) [14]. Кроме того, BPI действует как антиангиогенный фактор, индуцируя апоптоз в эндотелиальных клетках и связываясь с фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) [15]. Имеются также данные о том, что BPI влияет на компенсаторные механизмы организма, вызванные эндотоксинемией и окислительным стрессом: BPI ослабляет вызванные ЛПС изменения сосудистой реактивности, ингибируя экспрессию iNOS, что приводит к восстановлению чувствительности сосудов к вазоконстрикторам [16].

Существуют исследования, демонстрирующие тесную взаимосвязь между изменениями кишечной микробиоты, эндотоксинемией и развитием системного воспаления при подагре [17]. Дисбиоз кишечника приводит к повышению проницаемости кишечного барьера и транслокации липополисахарида (ЛПС) в системный кровоток, что инициирует каскад воспалительных реакций через активацию Toll-подобных рецепторов, в частности TLR4 [17, 18]. Липополисахарид-связывающий белок (ЛСБ) служит ключевым медиатором этого процесса, обеспечивая связывание эндотоксина и его презентацию комплексу CD14/TLR4/MD2 на иммунных клетках, что запускает провоспалительный сигнальный каскад [17, 18]. Эндотоксинемия способствует развитию окислительного стресса, нарушению функции эндотелия и активации провоспалительных цитокинов, что усугубляет метаболические нарушения и сосудистые осложнения при подагре [17, 18]. В этом контексте BPI и ЛСБ представляют собой интегральные маркеры, отражающие состояние оси «кишечник — эндотоксинемия — системное воспаление», что определяет их высокое клиническое значение для оценки тяжести заболевания и прогнозирования сосудистых осложнений [17, 18].

Можно предположить, что повышенный уровень ЛСБ у пациентов с подагрой, который мы наблюдали, является ответом на транслокацию бактериальных компонентов, а сниженная концентрация BPI может быть обусловлена десинхронизацией соотношения ЛСБ/BPI. Это предположение согласуется с данными о значительно более высоком сродстве BPI к ЛПС по сравнению с ЛСБ (Kd BPI ≈ 2,6 нМ против Kd LBP ≈ 58 нМ для липида А) . Следовательно, снижение уровня BPI потенциально может быть связано с его «затратой» на инактивацию провоспалительных свойств ЛПС, а также с общим окислительным стрессом, характерным для гиперурикемии [17, 18].

Нейтрализуя эндотоксины [19, 20], BPI может опосредованно защищать эндотелиальные клетки от избыточной активации и LPS-индуцированного повреждения [21]. Показано, что BPI подавляет экспрессию индуцибельной NO-синтазы (iNOS), что способствует восстановлению чувствительности сосудов к вазоконстрикторам и нормализации сосудистого тонуса. Кроме того, BPI ингибирует высвобождение провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1, IL-6) в ответ на LPS, что также снижает эндотелиальную дисфункцию [19, 21]. Таким образом, у пациентов с более высоким компенсаторным ответом в виде продукции BPI, вероятно, лучше сохраняется функция эндотелия, что может отражать выявленная нами регрессионная модель. При сравнении группы контроля с исследуемой видно, что концентрация BPI в плазме крови пациентов с подагрой снижена относительно контрольной группы. Можно предположить, что в данном случае BPI «затрачивается» на процессы, связанные с ингибированием LPS и противовоспалительные эффекты, что согласуется с конкурентными отношениями BPI и LBP, где BPI обладает более высоким сродством к LPS [20, 22].

Ограничения исследования

1. Дизайн исследования. Исследование имеет одномоментный (поперечный) дизайн, что не позволяет установить причинно-следственные связи между изучаемыми маркерами. Выявленная корреляция между уровнями BPI и NOS3 может быть обусловлена влиянием неучтённых факторов, таких как метаболический статус, длительность заболевания или генетические полиморфизмы. Для подтверждения полученных результатов необходимы дальнейшие проспективные исследования.
2. Отсутствие измерения концентрации ЛПС (эндотоксина). В работе не проводилось прямое определение уровня липополисахарида (ЛПС) в плазме крови. Это ограничивает возможность напрямую связать изменения BPI и ЛСБ с фактической эндотоксинемией и подтвердить гипотезу об «истощении» BPI.
3. Отсутствие прямых функциональных тестов эндотелия. Концентрация NOS3 в плазме использовалась как маркер эндотелиальной функции, однако она не всегда коррелирует с активностью фермента и продукцией оксида азота (NO) in vivo. Желательно дополнять такие измерения функциональными пробами (например, Flow-Mediated Dilation; FMD) или измерением стабильных метаболитов NO (нитриты/нитраты).
4. Не учтена генетическая гетерогенность BPI. Известно, что существуют функционально значимые полиморфизмы гена BPI (например, rs4358188, rs5743503), влияющие на его экспрессию и активность. В исследовании не проводилось генотипирование, что могло бы объяснить часть межиндивидуальной вариабельности уровней BPI и его ассоциации с NOS3.
5. Не оценивался приём лекарственных препаратов. Хотя из исследования исключались пациенты, принимавшие антибиотики или пробиотики, не анализировалось влияние уратснижающей терапии (аллопуринол, фебуксостат) и гипотензивных препаратов на уровни BPI и NOS3, что могло внести дополнительную вариабельность.
6. Относительно небольшой размер выборки (n=41 в группе подагры) ограничивает статистическую мощность для стратифицированного анализа по подгруппам (например, при разделении по наличию АГ или СД 2 типа, где группы становились малыми).
7. Группа контроля не полностью сопоставима по ИМТ и возрасту. У пациентов с подагрой был значимо выше индекс массы тела (p=0,006) и наблюдалась тенденция к старшему возрасту. Ожирение и возраст сами по себе влияют на уровень хронического воспаления, эндотоксинемию и эндотелиальную функцию, что могло частично объяснить выявленные различия.

Заключение

Нами выявлено, что у пациентов с подагрой существует статистически значимая положительная корреляция между концентрацией BPI (bactericidal/permeability-increasing protein) и уровнем эндотелиальной NO-синтазы (NOS3/eNOS). Это свидетельствует о тесной взаимосвязи между факторами врождённого иммунитета и маркерами сосудистой функции при подагре. Полученные данные позволяют предположить, что BPI может обладать протективным действием в отношении эндотелия в условиях хронического воспаления и окислительного стресса, вызванного гиперурикемией, что согласуется с известной способностью BPI нейтрализовать LPS-индуцированное повреждение эндотелиальных клеток и подавлять экспрессию индуцибельной NO-синтазы (iNOS). Однако механизмы, лежащие в основе выявленной корреляции между BPI и eNOS, требуют дальнейшего изучения. Выявленная ассоциация подчёркивает перспективность применения комплексной биомаркерной панели (BPI + NOS3) для мониторинга сосудистых осложнений и индивидуализации терапии пациентов с подагрой. Таким образом, BPI может рассматриваться как потенциальный сосудопротекторный маркер, отражающий компенсаторные защитные механизмы у пациентов с подагрой, что открывает новые возможности для дальнейших исследований в области профилактики и лечения сосудистых осложнений при подагре.