Полиморфизмы CYP1 и толщина эндометрия в день введения триггера овуляции

Введение

Эндометрий представляет собой сложную высокодифференцированную ткань, выстилающую внутреннюю полость матки, уникальной особенностью которой является способность к циклической регенерации, дифференцировке и десквамации на протяжении всего репродуктивного периода женщины [1]. Функционирование эндометрия находится под строгим контролем стероидных гормонов яичников, среди которых ключевая роль принадлежит эстрогенам [1, 2]. Нарушение гормональной регуляции эндометрия приводит к широкому спектру патологических состояний, включая гиперпластические процессы, эндометриоз и злокачественные новообразования, а также является одной из причин снижения рецептивности эндометрия в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [1].

Эффективность действия эстрогенов в эндометрии, определяется не только концентрацией гормонов в крови, но и скоростью их биотрансформации, обусловленной активностью ферментов [1]. Первую фазу окислительной детоксикации эстрогенов обеспечивают изоферменты суперсемейства цитохрома P450 (CYP) — CYP1A1, CYP1A2 и CYP1B1 [3]. Индивидуальные различия в функционировании этих ферментов, обусловленные генетическим полиморфизмом, могут приводить к существенной вариабельности ответа эндометрия на стимуляцию в программах ЭКО [3-5].

CYP1A1, CYP1A2 и CYP1B1 осуществляют гидроксилирование эстрадиола и эстрона с образованием метаболитов (2-гидроксиэстрон, 2-гидроксиэстрадиол, 4-гидроксиэстрон), которые различаются по эстрогенной активности и генотоксическому потенциалу [3]. В печени основную роль в 2-гидроксилировании эстрадиола выполняет CYP1A2, тогда как во внепечёночных тканях аналогичную активность проявляет CYP1A1. CYP1B1 характеризуется высокой экспрессией в эстроген-чувствительных тканях и специфически катализирует образование 4-гидроксиэстрогенов, обладающие генотоксическим потенциалом [6].

В основе протокола контролируемой овариальной стимуляции (КОС), применяемого в рамках программы ЭКО, лежит использование экзогенных гонадотропинов в дозах, превышающих физиологические, для запуска роста нескольких фолликулов, что закономерно сопровождается избыточной секрецией эстрадиола. Создаваемая таким образом стероидная гипернагрузка организма модифицирует процесс созревания эндометрия и способствует сдвигу периода максимальной рецептивности матки — так называемого «имплантационного окна» [7, 8].

Понимание того, как эстрогены регулируют пролиферативные процессы в эндометрии, имеет прямое практическое значение, особенно для программ ЭКО, ввиду широкого распространения проблемы недостаточного нарастания эндометрия («тонкого» эндометрия) при использовании стандартных схем гормональной поддержки.

Цель исследования

Определить ассоциацию полиморфных вариантов генов ферментов метаболизма эстрогенов — CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 с ответом эндометрия на фармакотерапию в программах ЭКО у женщин с ановуляторным бесплодием.

Материалы и методы

Дизайн и участники. В проспективное наблюдательное пилотное клиническое исследование с использованием фармакогенетического анализа, одобренное локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева» (протокол №116 от 12.05.2023), включены 265 пациенток с женским бесплодием, связанным с отсутствием овуляции (код по МКБ-10: N97.0), в возрасте 25–35 лет (30,5±2,5 года). Набор проводился на базе отделения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) Перинатального центра ГБУЗ РМ «Мордовская республиканская центральная клиническая больница» (Саранск) в период с мая 2023 г. по январь 2025 г. Все участницы подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.

Критерии отбора. После применения критериев включения и исключения финальную выборку составили 96 пациенток. Критерии включения: возраст 25–35 лет; документально подтверждённое ановуляторное бесплодие (код по МКБ-10: N97.0); нормальный овариальный резерв; отсутствие эндометриальной патологии по УЗИ и гистероскопии; нормальный кариотип пары. Критерии исключения: бесплодие, обусловленное мужским фактором; ИМТ >30 кг/м²; курение; экстрагенитальная или генитальная патология, при которой противопоказано проведение программы ЭКО; отказ пациентки от участия.

Протокол ЭКО и оценка эндометрия. Все участницы получили стандартизированное лечение по короткому протоколу с антагонистами ГнРГ (ганиреликс или цетрореликс 0,25 мг/сут п/к) и рекомбинантным фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) (фоллитропин альфа, стартовая доза 100–150 МЕ/сут п/к с коррекцией). Триггер финального созревания ооцитов — хориогонадотропин альфа (250 мкг п/к). Ведение пациенток соответствовало национальным клиническим рекомендациям по лечению женского бесплодия и применению ВРТ.

Конечной точкой исследования являлась толщина эндометрия (мм) в день введения триггера овуляции по данным УЗИ как маркер пролиферативного ответа эндометрия на стимуляцию. Пороговые значения: тонкий — менее 7,0 мм, оптимальный — 7–14 мм, гиперплазированный — более 14 мм. У 8 женщин был диагностирован «тонкий эндометрий», у 88 чел. — оптимальная толщина.

Генотипирование. Венозную кровь (6 мл) собирали в пробирки с ЭДТА, хранили при -20 °С (краткосрочно) и -70 °С (длительно). ДНК экстрагировали магнитно-сорбентным методом («Genotek», Россия) на автоматической станции Allsheng Auto-Pure 96 (Китай). Генотипирование выполнено методом полногеномного анализа на биочипах Infinium GSA-24 v3.0 («Illumina», США) с системой iScan согласно протоколу Infinium HTS Assay [9] на базе лаборатории ООО «ГЕНОТЕК». Анализировали 13 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), отобранных на основании систематического обзора литературы как маркёры с потенциальной прогностической значимостью в отношении исходов ЭКО: CYP1A1 — rs1048943, rs1800031, rs2606345, rs4646903, CYP1A2 — rs762551, rs2069514, rs2470890, CYP1B1 — rs1056836, rs1056837, rs10012, rs1056827, rs2855658, rs2617266. Все этапы генетического анализа, включая экстракцию ДНК, генотипирование и хранение биоматериала, проводились исключительно на территории Российской Федерации. Трансграничная передача генетических данных не осуществлялась, что полностью соответствует требованиям Федерального закона № 86-ФЗ.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения Statistica 12.5 (StatSoft, США). Проверку нормальности распределения количественных признаков выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка; данные представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (M±SD). Для межгрупповых сравнений количественных показателей применяли t-критерий Стьюдента. Для контроля групповой вероятности ошибки первого рода при множественном тестировании применялась поправка Бенджамини-Хохберга (FDR). Для оценки самостоятельного вклада изучаемых генетических вариантов и нивелировать возможное влияние сопутствующих переменных, был применён множественный регрессионный анализ. Расчёт статистической мощности выполнялся с использованием программного обеспечения G*Power (версия 3.1). При объёме выборки n=96, заданном уровне значимости α=0,05 и выявленной разнице толщины эндометрия между гомо- и гетерозиготами (в среднем 0,8–1,2 мм, стандартизованный размер эффекта Cohen's d >0,6), расчётная статистическая мощность (1-β) для ключевых ассоциаций превысила 80%, что свидетельствует о достаточности выборки для выявления клинически значимых эффектов. Критический уровень статистической значимости при проверке нулевых гипотез принимали равным p <0,05.

Результаты

Оценка соответствия распределения частот аллелей и генотипов закону Харди-Вайнберга проводилась для всех 13 проанализированных полиморфных маркеров (табл. 1). Как показали расчёты, в исследуемой когорте (n=96) фактическое распределение генотипов по всем изученным локусам генов CYP1A1, CYP1A2 и CYP1B1 не имело статистически значимых отличий от теоретически ожидаемых значений (критерий χ², p >0,05 во всех случаях). Полученные данные объективно свидетельствуют о том, что обследованная выборка находится в состоянии популяционного равновесия. Это, в свою очередь, подтверждает корректность проведённого этапа генотипирования и позволяет исключить вероятность систематических ошибок, которые могли бы быть связаны с популяционной стратификацией.

Таблица 1

Равновесие Харди-Вайнберга для изучаемых полиморфизмов

В ходе пилотного исследования проведена оценка ассоциации полиморфных вариантов генов ферментов семейства CYP1 (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1) с толщиной эндометрия в день введения триггера овуляции у пациенток с ановуляторной формой бесплодия. Статистически значимые различия между носителями разных генотипов выявлены для ряда полиморфных локусов (табл. 2).

В гене CYP1A1 для полиморфизма rs2606345 выявлены различия между генотипами С/А и А/А (9,1±0,8 мм против 8,6±0,6 мм, p=0,003).

В группе гена CYP1A2 по полиморфизму rs762551 наблюдалась генотип-зависимая градация: толщина эндометрия последовательно увеличивалась от генотипа C/C (8,2±0,3 мм) к C/А (8,4±0,8 мм) и А/А (9,1±0,7 мм), причём различия между C/C и А/А, а также между C/А и А/А были статистически значимы (p <0,001). Аналогичная картина наблюдалась для rs2470890, где гомозиготный генотип С/С (8,1±0,2 мм) ассоциировался с достоверно меньшей толщиной эндометрия по сравнению как с C/Т (8,8±0,9 мм, p=0,007), так и с Т/Т (9,0±0,5 мм, p <0,001).

В гене CYP1B1 статистически значимые различия зафиксированы для трёх полиморфизмов: rs10012, rs1056827 и rs2617266, причём данные для этих локусов были идентичными. Носители гомозиготного генотипа C/C rs10012, A/A rs1056827, A/A rs2617266 имели наибольшую толщину эндометрия — 9,4±0,5 мм, чем носители гетерозиготных генотипов (8,6±0,4 мм, p <0,001) и носители генотипа G/G rs10012, C/C rs1056827 и G/G rs2617266 (p=0,015).

Для остальных изученных полиморфных вариантов статистически значимых различий в толщине эндометрия между группами носителей разных генотипов выявлено не было (p >0,05).

Среди женщин с «тонким» эндометрием (n=8) все пациентки были носителями аллеля С rs762551 и rs2470890 гена CYP1A2, генотипа G/G rs2069514, генотипа T/T rs1048943, A/A rs4646903 гена CYP1A1, G/G rs10012, C/C rs1056827, G/G rs2617266 гена CYP1B1, однако из-за ограниченного числа наблюдений эти данные следует рассматривать как предварительные, требующие подтверждения в больших выборках.

Построенная регрессионная модель подтвердила, что полиморфизмы гена CYP1A2 детерминируют изменение толщины эндометрия вне зависимости от исходных клинико-антропометрических характеристик. Так, наличие генотипа А/А по локусу rs762551 оказалось независимым фактором, ассоциированным с увеличением толщины слизистой оболочки матки (нестандартизованный коэффициент B=0,82; 95% ДИ: 0,35–1,29; β=0,41; p=0,002). В свою очередь, носительство гомозиготного варианта С/С rs2470890 достоверно выступало независимым предиктором недостаточного нарастания эндометрия (B = -0,85; 95% ДИ: -1,31 — -0,39; β = -0,44; p=0,001).

Таблица 2

Толщина эндометрия (мм, M±SD) в день введения триггера овуляции в зависимости от генотипов полиморфизмов генов CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1

Ограничения исследования

Несмотря на новизну полученных данных, необходимо учитывать ограничения исследования. Относительно небольшой объём выборки (n=96) не позволяет с полной уверенностью экстраполировать результаты на всю популяцию, что требует подтверждения на более многочисленных когортах. Кроме того, функциональное значение выявленных полиморфных вариантов остаётся неизученным. Для окончательного заключения о причинно-следственной связи необходимы дополнительные функциональные исследования (например, оценка активности CYP1B1 в культурах клеток эндометрия с различными генотипами) и репликация результатов в независимых выборках.

 Обсуждение

Толщина эндометрия в день введения триггера овуляции — это важный маркер для оценки эффективности готовности эндометрия к переносу эмбриона в программах ЭКО и ключевое звено для оценки фармакогенетических влияний. Обнаруженные ассоциации полиморфизмов rs2470890, rs762551 гена CYP1A2 и rs10012, rs1056827, rs2617266 гена CYP1B1 с толщиной эндометрия в день введения триггера овуляции указывают на то, что генетически детерминированные особенности метаболизма эстрогенов могут напрямую влиять на пролиферативную реакцию эндометрия в условиях гиперэстрогении, индуцированной КОС.

Фермент CYP1A2 экспрессируется преимущественно в печени и отвечает за гидроксилирование эстрадиола и эстрона с образованием 2-гидроксиэстрогенов, которые обладают значительно меньшей биологической активностью, чем сам эстрадиол [3]. Два полиморфизма — rs762551 и rs2470890 — локализованы в интронных областях гена CYP1A2 и могут модулировать активность кодируемого фермента, тем самым влияя на системный метаболизм эстрогенов. Обнаруженные ассоциации этих полиморфизмов с толщиной эндометрия указывают на то, что генетически детерминированная скорость печёночного клиренса эстрадиола может напрямую определять пролиферативную реакцию ткани матки в условиях КОС.

Полиморфизм rs762551 (-163C>A) гена CYP1A2 выступает важным маркером базальной активности фермента. Особенность данного локуса заключается в его высокой чувствительности к внешним индукторам, таким как курение [10]. В условиях отсутствия индукции носители генотипа А/А демонстрируют более низкую базальную активность фермента («медленные метаболизаторы») по сравнению с носителями аллеля С [10, 11]. В нашем исследовании именно у пациенток с генотипом А/А зафиксирована наибольшая толщина эндометрия. С фармакокинетической точки зрения это легко объяснимо: у некурящих женщин с генотипом А/А печёночный клиренс синтезируемого растущими фолликулами эстрадиола снижен. Гормон дольше циркулирует в крови, достигает более высоких системных концентраций и обеспечивает более длительное воздействие на рецепторы матки. В свою очередь, аллель С (генотипы А/С и С/С) ассоциирован с повышенной базовой транскрипцией фермента [12, 13]. У таких пациенток системный клиренс эстрадиола происходит быстрее, поэтому стимулирующее воздействие эстрогенов на эндометрий может быть слабее при той же дозе рекомбинантного ФСГ. Таким образом, медленный метаболизм у пациенток А/А обеспечивает лучшую эстрогенную поддержку эндометрия в протоколах ЭКО.

Особого внимания заслуживает регуляторный полиморфизм rs2470890 (-1545C>T). В нашей выборке гомозиготный генотип C/C ассоциировался с достоверно меньшей толщиной эндометрия по сравнению с гетерозиготами и гомозиготами по аллелю Т. В литературе имеются единичные данные (исследование в китайской популяции), связывающие генотип C/C с более низкой экспрессией белка CYP1A2 [14]. Однако клинический фенотип, зафиксированный в нашем исследовании («тонкий» эндометрий), указывает на то, что в условиях КОС генотип С/С реализуется как профиль ускоренного метаболизма, приводящего к недостаточной эстрогенной стимуляции рецепторного аппарата матки. Подобное расхождение с данными литературы может объясняться популяционной специфичностью. Вероятно, что в европейской популяции аллель С полиморфизма rs2470890 гена находится в сильном неравновесном сцеплении с другими высокоактивными промоторными вариантами гена CYP1A2, что ведёт к ускоренной элиминации эстрадиола. Таким образом, носительство генотипа C/C rs2470890 в изученной когорте выступает прогностическим маркером риска недостаточного роста эндометрия вследствие форсированного системного клиренса эстрогенов.

CYP1B1 — единственный фермент, который наиболее эффективно осуществляет 4-гидроксилирование эстрадиола [6]. Этот путь метаболизма имеет принципиальное значение, поскольку 4-гидроксиэстрогены, в отличие от 2-гидроксиметаболитов, сохраняют высокое сродство к эстрогеновым рецепторам и обладают выраженной эстрогенной активностью. Кроме того, в процессе редокс-циклирования 4-гидроксиэстрогены образуют семихиноны и хиноны, способные вызывать повреждение ДНК, однако для физиологической пролиферации эндометрия ключевым является именно их рецептор-опосредованное действие [15, 16].

Проведённое исследование впервые выявило ассоциацию гомозиготных генотипов C/C rs10012, A/A rs1056827 и A/A rs2617266 гена CYP1B1 с наибольшей толщиной эндометрия в день введения триггера овуляции у пациенток с ановуляторным бесплодием в программах ЭКО. Примечательно, что для трёх различных полиморфных локусов была получена идентичная картина распределения толщины эндометрия, что может свидетельствовать либо о полном неравновесном сцеплении между ними, либо о совместном влиянии на функцию фермента.

Учитывая, что rs10012 и rs1056827 представляют собой миссенс-полиморфизмы, приводящие к аминокислотным заменам Arg48Gly и Ala119Ser соответственно, а rs2617266 локализован в 5'-нетранслируемой области на расстоянии 12 п.н. выше первого кодирующего экзона, можно предположить, что они находятся в состоянии неравновесного сцепления. В пользу этого свидетельствуют данные литературы о формировании гаплотипов внутри гена CYP1B1, объединяющих, в частности, rs2617266, rs10012 и rs1056827 [17].

Таким образом, сочетание генотипов C/C rs10012, A/A rs1056827 и A/A rs2617266, вероятно, формирует гаплотип, который характеризуется снижением локальной активности CYP1B1 в эндометрии, что приводит к уменьшению образования генотоксичных 4-гидроксиметаболитов и локальной кумуляции активного эстрадиола, обеспечивая пролонгированную стимуляцию рецепторов и усиление пролиферации эндометрия. При стимуляции, когда уровень эстрадиола очень высок, этот гаплотип активнее превращает его в защитный, менее активный метаболит (2-гидроксиэстрадиол) и не перегружает эндометрий токсичным 4-гидроксиэстрадиолом. Это ведёт к снижению локального «гормонального стресса» в эндометрии и создаёт более благоприятную среду для пролиферации, что и проявляется как увеличение толщины.

Полученные данные по CYP1B1 согласуются с результатами по CYP1A2, создавая единую картину эстрогенового баланса. Конкурентный метаболизм эстрадиола с участием CYP1A2 (преимущественно в печени) и CYP1B1 (локально в эндометрии) может определять баланс активных и неактивных метаболитов, влияя на пролиферативный ответ.

Заключение

Результаты проведённого исследования показали, что толщина эндометрия в день введения триггера овуляции ассоциирована с полиморфизмами rs762551, rs2470890 гена CYP1A2, rs10012, rs1056827, rs2617266 гена CYP1B1, что указывает на потенциальную значимость этих генетических маркеров для персонализации протоколов подготовки эндометрия у пациенток в циклах ЭКО.

У обследованных пациенток с ановуляторным бесплодием выявлены ассоциации полиморфизмов CYP1A2 и CYP1B1 с толщиной эндометрия, что может указывать на роль генетически обусловленного метаболизма эстрогенов в формировании пролиферативного ответа. В то время как CYP1A2 определяет преимущественно системный уровень эстрогенов, CYP1B1 действует локально, непосредственно в эндометрии. Можно предположить, что оптимальная пролиферативная реакция эндометрия требует тонкого баланса между системной гормональной стимуляцией и локальным метаболическим контролем. Любое отклонение в работе этой сложной системы — нарушение системного или локального метаболизма, либо локальной конверсии эстрогенов — может приводить к снижению пролиферативного ответа. Полученные данные дополняют современные представления о роли генетически детерминированных особенностей метаболизма эстрогенов в регуляции пролиферативной активности эндометрия в условиях контролируемой овариальной стимуляции.