В последнее время получили развитие технологии децеллюляризации органов, таких как сердце, печень, почки [3-5]. Получаемые в результате бесклеточные матриксы могут служить каркасом для дальнейшего заселения специфичной клеточной популяцией. Подобный подход может быть применен и для конструирования тканеинженерного легкого, так как морфологическая структура внеклеточного матрикса обладает подходящей трехмерной архитектурой и специфичным для данного региона сигнальным комплексом для запуска механизмов клеточной адгезии. Для полноценного функционирования in vivo ткане-инженерное легкое должно обладать следующими характеристиками:

1. содержать специфичные для легкого клетки,
2. демонстрировать разветвленную геометрию дыхательных путей и обильную сеть кровеносных сосудов,
3. осуществлять барьерную функцию разделения крови и воздуха, и
4. обеспечивать механические возможности вентилирования при физиологических давлениях.

Исследователи из Йельского университета под руководством Лауры Никласон (Laura E. Niklason) опубликовали в журнале Science результаты своей работы по конструированию функционирующего тканеинженерного легкого на модели крысы. Оригинальный подход к решению поставленной задачи продемонстрирован на рисунке. Первая задача заключается в децеллюляризации нативной легочной ткани для удаления иммуногенных клеточных составляющих. Было обнаружено, что после тщательно проведенной процедуры децеллюляризации ткань сохраняет свою альвеолярную микроархитектуру, механические свойства и барьерную функцию для частиц. Вторым этапом работы было заселение свободного внеклеточного матрикса смешанной популяцией неонатальных эпителиальных клеток легкого, в результате чего было показано регионально-специфичное заселение в анатомически правильном месте. Для увеличения выживаемости клеток и улучшения условий для их дифференцировки в легочный эпителий матрикс культивировался в специально разработанном биореакторе, условия которого максимально соответствуют среде фетального легкого, включая сосудистое кровоснабжение и жидкостную вентиляцию. Третий этап работы заключался в тестировании функционирования полученной легочной ткани путем кратковременной имплантации с использованием изологичной крысиной модели.

Всего было выполнено четыре пересадки полученных конструкций животным. Обесклеточные матриксы были засеяны неонатальными клетками легочного эпителия и клетками капиллярного эндотелия и культивировались примерно неделю в биореакторе. У крыс удалялось левое легкое, и на его место пересаживалась полученная биоинженерная конструкция. Перед восстановлением кровоснабжения животные помещались в атмосферу 100% кислорода. Во всех случаях отмечалось удачная трансплантация легкого реципиенту без видимых утечек воздуха через паренхиму. Все пересаженные легкие заполнялись кровью за период от нескольких секунд до минуты, при этом отмечалось заметное изменение цвета крови от темного до ярко-красного за счет насыщения гемоглобина кислородом. Анализ насыщения крови кислородом показал, что биоинженерное легкое эффективно осуществляло газообмен кислорода и углекислого газа, хотя численные показатели за время функционирования трансплантата (от 45 минут до 2 часов) не достигли уровня здорового легкого.

Схема получения тканеинженерного легкого

В легочную артерию и трахею нативного легкого крысы вставлялись канюли для последующей инфузии децеллюляризирующего раствора. В течение 2-3 часов обработки все клеточные элементы были удалены, в результате чего был получен легочный каркас (легочный матрикс). Легочный матрикс помещался для культивирования в биореактор, где заселялся клетками легочного эпителия и эндотелиальными клетками. Через 4-8 дней культивирования тканеинженерное легкое изымалось из реактора и имплантировалось сингенному реципиенту.  

Дальнейшим развитием данного направления стало определение, насколько использованные технологии децелюляризации и репопуляции применимы к человеческим тканям. Из тканевого банка были получены фрагменты легкого человека, которые в дальнейшем были обработаны реагентами для удаления клеток в течение 6 часов. Используя гистологическое окрашивание, было показано, что было достигнуто полное удаление клеточного материала при сохранении альвеолярной архитектуры. Для дальнейшего заселения бесклеточного матрикса были выбраны клетки двух типов: клетки эпителиальной карциномы человека линии А549 и эндотелиальные клетки, полученные из эндотелиальных предшественников пуповинной крови человека. В результате клетки линии А549 хорошо прикреплялись к альвеолярным поверхностям, в то время как эндотелиальные клетки адгезировали в сосудистую сеть. Полученные данные говорят о возможности применения выбранного подхода к конструированию тканей человеческого легкого.

Авторы отмечают, что конструирование биоинженерного легкого является развитием направления по созданию и трансплантации тканей респираторной системы. Важным этапом в развитии данного направления стало клиническое применение стратегии децеллюляризации с последующим заселением клеток в биореакторе, осуществленное в 2008 году профессором Маккиарини с коллегами, когда пациентке с серьезными нарушениями трахеи была успешно пересажена тканеинженерная конструкция на основе засеянного клетками матрикса [6].

Продемонстрирована осуществимость создания тканеинженерного легкого, характеризующегося максимально приближенной микроархитектурой к нативному и эффективно осуществляющего свою главную функцию – газообмен, хотя бы в короткий промежуток времени и на модели лабораторных животных. Несмотря на полученные обнадеживающие результаты, для полноценной трансплантации тканеинженерных легких необходимо решить ряд проблем. Одной из них является сохранение функционирующего альвеолярного барьера. Пока современные технологии децеллюляризации не позволяют полностью избежать попадания крови в воздушные пути. Подобную проблему можно решить усовершенствованием процедуры децеллюляризации, подбирая щадящие условия для сохранения альвеолярной микроархитектуры.

Другой проблемой является недостаточный уровень функционирования клеток реснитчатого эпителия, решением может стать более длительное культивирование в биореакторе с подключением имитации процессов дыхания.

Также следует провести дополнительные исследования для улучшения процесса клеточного заселения эндотелия, для исключения возможного тромбообразования, отмечавшегося в экспериментах с крысами.

Наконец, клиническое применение стратегии децеллюляризации и последующего клеточного заселения для регенерации легкого возможно только при освоении доступного источника аутологичных клеток легочного эпителия, каким могут стать резидентные стволовые клетки легкого или индуцированные плюрипотентные клетки [7-8].

По материалам: Petersen T.H., Calle E.A., Zhao L., Lee E.J., Gui L., Raredon M.B., Gavrilov K., Yi T., Zhuang Z.W., Breuer C., Herzog E., Niklason L.E. Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation. Science 2010; 329: 538-541.

Библиография

1. American Lung Association, Lung Disease Data 2008, http://www.lungusa.org/, accessed 4 March 2010. []
2. Orens J. B., Garrity E. R. Jr. General Overview of Lung Transplantation and Review of Organ Allocation. Proc. Am. Thorac. Soc. 2009; 6: 13-19. [Abstract]
3. Ott H.C., Matthiesen T., Goh S-K. et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature"s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 2008; 14: 213-21. [Abstract]
4. T. W. Gilbert, T. L. Sellaro, S. F. Badylak. Decellularization of tissues and organs Biomaterials2006; 27: 3675-83. [Abstract]
5. P.M. Baptista, G. Orlando, S.H. Mirmalek-Sani et al. Whole organ decellularization - a tool for bioscaffold fabrication and organ bioengineering. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 2009; 31: 6526-29. [Abstract]
6. Macchiarini P., Jungebluth P., Go T. et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. . Lancet 2008; 372: 2023-30. [Abstract]
7. H. J. Rippon, S. Lane, M. Qin et al. Embryonic stem cells as a source of pulmonary epithelium in vitro and in vivo. Proc. Am. Thorac. Soc2008. 5: 717-22. [Abstract]
8. B. Roszell, M.J. Mondrinos, A. Seaton et al. Efficient Derivation of Alveolar Type II Cells from Embryonic Stem Cells for In Vivo Application Tissue Eng. Part A2009. 15: 3351-3365. [Abstract]

Источник: celltranspl.ru