Трансфузия эритроцитарной массы является одним из немногих эффективных методов лечения патологических состояний, при которых наблюдается недостаточная оксигенация тканей. Несмотря на то, что ежегодно в мире заготавливается более 75 миллионов образцов крови [1], часто возникают ситуации острого дефицита этих препаратов. Поэтому усилия многих исследовательских групп вплоть до настоящего времени направлены на разработку кровезамещающих растворов - переносчиков кислорода (модифицированный гемоглобин, перфторуглеродные соединения и др.). С другой стороны, в связи с появлением эффективных протоколов дифференцировки плюрипотентных и гемопоэтических стволовых клеток, реальной альтернативой классическим продуктам для трансфузий могут стать получаемые in vitro эритроциты. Соблюдение условий GMP и стандартизация производства будут служить залогом их высокого качества и значительно более низкого риска переноса инфекционных агентов.

В настоящее время можно добиться полного созревания клеток эритроидного ряда in vitro вплоть до стадии энуклеациипри культивировании гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) периферической крови, костного мозга, пуповинной крови, печени плода, а также при культивировании ЭСК и иПСК [2]. Тем не менее, еще не было описано реальных случаев введения получаемых в культурах эритроцитов человеку, а значит, возможность применения такого продукта в клинике оставалась гипотетической.

1 сентября 2011 года в on-line версии Blood опубликована работа большой группы французских ученых и клиницистов, возглавляемых профессором Luc Douay, в которой сообщается о проведении первой в мире инфузии выращенных in vitro эритроцитов человеку.

Для получения эритроцитов в исследовании использовалась одна из модификаций разработанного ранее протокола культивирования и дифференцировки ГСК [3]. На первом этапе авторы изучали основные характеристики получаемых эритроцитов и пытались получить ответы на ряд ключевых вопросов: насколько зрелыми являются получаемые в использованных условиях энуклеированные клетки?; способны ли они осуществлять свойственные эритроцитам функции?; можно ли их подвергнуть консервации для последующего использования?; какова судьба этих клеток при их введении иммунодефицитным мышам? Получение таких данных было необходимо для обоснования проведенной в дальнейшем инфузии человеку выращенных в культуре эритроцитов, меченных радиоактивной меткой (51Cr).

После кратковременного курса Г-КСФ у доноров забиралась обогащенная гемопоэтическими клетками кровь, которая подвергалась лейкаферезу. CD34+клетки выделялись с помощью иммуномагнитной сепарации и культивировались в среде, поддерживающей дифференцировку в эритроидном направлении. Амплификация клеток достигала плато к 18 сут. культивирования. К этому времени их количество увеличивалось в среднем в 61,5 тысяч раз. Процент энуклеированных клеток составлял около 80%. На этом этапе абсолютное большинство клеток имело фенотип ретикулоцитов, что было выявлено визуально при окрашивании метиленовым синим и с помощью проточной цитометрии при окрашивании thiazole-orange. Средние показатели индексов эритроцитов MCV (mean cell volume), MCH (mean cell hemoglobin) иMCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration) составили соответственно 138±4,2 фл, 35±1,6 пг и 25±0,5%, соответственно. Показатель MCV в сравнении с нативными ретикулоцитами был несколько увеличен. Соответствие ретикулоцитам было подтверждено и при анализе иммунофенотипа – исследуемые клетки экспрессировали гликофорин A, трансферриновый (CD71) и тромобосподиновый (CD36) рецепторы.

Полученные в культуре эритроциты содержали в среднем 88-90% гемоглобина А (нормальный гемоглобин эритроцитов взрослого человека) и 10-12% фетального гемоглобина, что в 10 раз превышает его содержание у взрослых людей. Изучение кривых равновесия показало, что суспензия культивированных эритроцитов обратимо связывала кислород аналогично нативным эритроцитам.

Меченные культивированные эритроциты вводились иммунодефицитным мышам (NOD/SCID). Отслеживая их судьбу, авторы показали, что в течение трех дней эти клетки претерпевали ряд изменений, которые свидетельствовали об их окончательном созревании in vivo: уменьшались в размерах; приобретали характерную дисковидную морфологию; подавлялась характерная для ретикулоцитов экспрессия CD71; терялись остатки нуклеиновых кислот (см. рис.).

Конфокальная микроскопия меченных CFSE клеток перед и после инъекции мышам в сравнении с нативными эритроцитами и ретикулоцитами. Рис. Из статьи с изм.

Изучение экспрессии антигенов на поверхности культивированных и нативных эритроцитов, полученных от одного донора, не выявило различий по каким-либо групповым антигенным системам, за исключением антигена H. Тем не менее, более низкий уровень H-антигена на культивированных клетках не оказывал существенного влияния на экспрессию антигенов системы AB0.

Аналогично нативным эритроцитам, очищенные культивированные клетки сохраняли все свои свойства после 4-недельного хранения при +4°C в консервирующей жидкости.

Получив удовлетворительные ответы на поставленные ранее вопросы, авторы выполнили инфузию культивированных эритроцитов человеку. В условиях, соответствующих стандартам GMP, 106 CD34+ ГСК были подвергнуты экспансии до общего количества 3,7×1010 клеток, у 68% из которых не было ядра. Клетки были пропущены через задерживающий лейкоциты фильтр. После мечения 51Cr полученные эритроциты вводились человеку. Выживаемость эритроцитов отслеживалась от 1 часа до 26 сут. от введения. Результаты, представленные как доля выживших клеток в период времени, представлены в табл. 1. В зависимости от использованных для расчетов средних скоростей высвобождения хрома (от 0,6 до 2,2% в сут.) к 26 дню в крови реципиента циркулировало от 41 до 63% введенных эритроцитов (см. табл.).

Выживаемость эритроцитов, выраженная в процентах от первоначального количества введенных клеток, в зависимости от выбранного коэффициента высвобождения хрома

Таким образом, авторы опубликованного сообщения впервые в мире провели инфузию выращенных in vitro эритроцитов человеку. Приблизительная оценка выживаемости показала, что около половины введенных клеток циркулировали в крови реципиента на 26 сут. после введения. Аналогичные показатели выживаемости эритроцитов характерны и при инфузии нативных клеток. Кроме того, в проведенных экспериментах было показано, что культивированные эритроциты обладают всеми необходимыми морфологическими и функциональными характеристиками. Вместе эти данные создают основу для использования полученных in vitro эритроцитов в дальнейших клинических испытаниях.

По материалам: Giarratana M.C., Rouard H., Dumont A.et al. Proof of principle for transfusion of in vitro generated red blood cells. Blood. 2011 Sep 1. [Epub ahead of print].

Литература:

1. Klein H.G, Spahn D.R, Carson J.L. Red blood cell transfusion in clinical practice. Lancet 2007;370(9585):415-26.

2. Migliaccio A.R., Whitsett C., Migliaccio G. Erythroid cells in vitro: from developmental biology to blood transfusion products. Curr.Opin.Hematol. 2009;16(4):259-68.

3. Giarratana M.C., Kobari L., Lapillonne H. et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat.Biotechnol. 2005;23(1):69-74.

Источник: celltranspl.ru