Потенциальное место ингибиторов РАR2  в терапии ревматоидного артрита

Введение / Introduction

Ревматоидный артрит (РА) — неизлечимое на сегодняшний день иммуновоспалительное заболевание с многофакторной этиологией, от которого страдает до 1,0 % населения Земли [1][2], его распространённость увеличивается с возрастом. По данным официальной статистики, в 2017 году в России зарегистрировано более 300 тысяч пациентов с РА, в то время как, по данным Российского эпидемиологического исследования РА, страдает около 0,6 % от общей популяции [3–5].

Развитие хронического воспаления при РА определяется комплексным взаимодействием факторов внешней среды, генетической предрасположенности, патологией микробиома, эпигенетическими и иммунометаболическими нарушениями [6][7]. Так, риск заболевания на 60 % обусловлен генетическими факторами (гены восприимчивости HLA-DRB1, TNFRSF14 и PTPN22), которые тесно связаны с возникновением РА [8]. Также развитие заболевания сопряжено и с нарушениями функционирования иммунной системы; в его патогенезе задействованы механизмы как врождённого, так и адаптивного иммунитета [9].

Прогрессирование заболевания приводит к деформации суставов, разрушению хрящевой и костной ткани и последующей инвалидизации [8][10], а также сопровождается системными болями и развитием внесуставных органных проявлений: имеет место увеличение частоты развития заболеваний ССС (1,5 раза увеличивает риск сердечно-сосудистых заболеваний и смертности) [10][12], возможны поражения почек, лёгких, печени, кожи, нервной системы [13], нарушения слуха [14].

РА характеризуется отёком, болью, потерей подвижности в суставах, что связано с развитием аутоиммунной реакции и выработкой антител, повреждающих суставы. Это приводит к адаптивному иммунному ответу на аутоантигены, такие как IgG (ревматоидный фактор) или посттрансляционно модифицированные белки (цитруллинированный белок) [15][16]. Воспалительный синовиальный инфильтрат при РА состоит из аутореактивных В- и Т-клеток, воспалительных моноцитов и тучных клеток, которые продуцируют провоспалительные цитокины (например, TNF-α, IL-1β и IL-6), хемокины (например, CCL2 и CXCL8) и катаболические протеазы. Гиперплазия фибробластоподобных синовиоцитов способствует структурным повреждениям синовиальной мембраны, создавая инвазивный паннус, который может разрушить и соседние ткани. Структурные повреждения также могут быть вызваны инфильтрацией иммунных клеток, проникающей в околосуставную кость и кальцинированный хрящ [17]. Металлопротеиназы (такие как ММП-1, 8, 13 и 14) высвобождающиеся из хондроцитов и клеток синовиальной оболочки, также способствуют разрушению хрящевого матрикса [15][18–21].

В настоящее время в лечении РА доминирует стратегия «лечение до достижения цели» (англ. treat to target; T2T), принятая в 2010 году [22]. Она не рекомендует какие-то конкретные препараты, а даёт лишь общие рекомендации по проведению лечения. Основная цель фармакотерапии РА — достижение ремиссии (или низкой активности) заболевания, под которой прежде всего понимают отсутствие воспалительной активности, а также снижение риска коморбидных заболеваний [5].

При медикаментозном лечении РА используются несколько классов разнообразных по химической структуре и фармакологическим свойствам лекарственных средств, каждый из которых обладает своими достоинствами и недостатками [8][24]. Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) широко используются в терапии РА, для снятия как острых, так и хронических болей. С этой целью используются неселективные (ингибируют и ЦОГ-1, и ЦОГ-2: диклофенак, нимесулид, мелоксикам, кетопрофен и др.) и селективные (ингибируют только ЦОГ-2: целекоксиб, эторикоксиб и др.) блокаторы циклооксигеназ. При этом они не оказывают какого-либо эффекта на течение болезни, не предотвращают её прогрессирование и развитие сопутствующих осложнений. В то же время сами могут вызывать тяжёлые нежелательные реакции со стороны желудочно-кишечного тракта и кардиоваскулярной системы [5][24][25].

Терапевтическая эффективность хондропротекторов, содержащих глюкозамин и хондроитин, находится под вопросом, так как не подтверждена соответствующими клиническими исследованиями.

Лечение РА глюкокортикоидами (метилпреднизолон или дексаметазон) может сопровождаться развитием системных побочных эффектов (в том числе и со стороны иммунной и эндокринной систем), требующих тщательного мониторинга, и рекомендуется в комбинации с базисными противовоспалительными препаратами в качестве компонента комбинированной терапии [5][26].

Базисные противовоспалительные препараты (БПВП) [ (эквивалентно термину «болезнь — модифицирующие антиревматические препараты» (англ. disease modifying antirheumatic drugs; DMARD)] представляют собой обширную группу самых разнообразных синтетических и биологических лекарственных средств, которые объединяет их способность влиять на патогенетические механизмы РА и соответственно, как прекращать воспалительные процессы, так и предотвращать прогрессирование болезни и развитие сопутствующих осложнений. БПВП принято подразделять на синтетические и биологические [5][27][28].

Традиционные (синтетические) базисные противовоспалительные препараты (тБПВП) используются в медицинской практике более 50 лет и представлены несколькими группами препаратов с различным строением и механизмом действия (табл. 1).

Цитостатики. Механизм их действия заключается в нарушении синтеза нуклеиновых кислот и белка во всех быстро регенерирующих тканях, включая клетки иммунной системы (В- и Т- лимфоцитов), синтез иммуноглобулинов и интерлейкинов. Их общий недостаток — значительная органная токсичность, проявляющаяся нарушениями со стороны ЖКТ, печени, почек, кроветворения и т. д. Наиболее часто используемым цитостатиком является метотрексат — антиметаболит фолиевой кислоты. Он относительно малотоксичен и, поэтому считается препаратом выбора. Метотрексат обладает дополнительным механизмом действия, связанным накопление в клетках аденозина — мощного противовоспалительного вещества. Это способствует дополнительному подавлению провоспалительных функций нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов, дендритных клеток. Он обладает и прямым угнетающим действием на пролиферацию клеток иммунной и воспалительной реакции, вызывая их апоптоз. Азатиоприн и циклофосфамид обладают значимо большей токсичностью, чем метотрексат, поэтому используются нечасто [5].

Ингибиторы кальциневрина циклоспорин и такролимус являются важными средствами лечения пациентов с активным ревматоидным артритом, особенно в случаях резистентности или непереносимости метотрексата или других противоревматических препаратов, модифицирующих заболевание. Сам кальциневрин является цитозольной фосфатазой, важной для активации Т-лимфоцитов [29]. При лечении активного ревматоидного артрита циклоспорин, как правило, комбинируется с метотрексатом, глюкокортикоидами и лефлуномидом. Такролимус используется как при монотерапии, так и в комбинации с метотрексатом. Побочные эффекты схожи с таковыми цитостатиками, хотя и менее выражены. У такролимуса наблюдаются достаточно частые центральные (психические) расстройства [30].

Хинолины (хлорохин, гидроксихлорохин) относятся к противомалярийным средствам. Механизм их действия хинолинов заключается в торможении реакции Т-лимфоцитов митогены, стабилизация лизосомальных мембран, снижении синтеза нуклеиновых кислот, уменьшении хемотаксиса лейкоцитов, в снижении активности свободнорадикального окисления. При РА их эффективность невысока. К наиболее частым побочным эффектам относятся нарушения ЖКТ (тошнота, рвота, понос), ночные кошмары и аллергические кожные высыпания; возможна ретинопатия [5].

К эфирам микофеноловой кислоты относится пролекарство микофенолата мофетил, который после приёма превращается в активную форму (микофеноловую кислоту). Это специфический ингибитор инозинмонофосфатдегидрогеназы — ключевого фермента синтеза гуанозиновых нуклеотидов, блокада которого приводит к подавлению пролиферации T- и B-лимфоцитов. При РА практически не применяется. Способна вызывать тяжёлые нарушения ЖКТ (боль в животе, тошнота, рвота, диарея), а также нарушения кроветворения, почек, ЦНС, сердечно-сосудистой системы, гипергликемию и др. [5]

Основным представителем блокаторов синтеза пиримидиновых оснований является лефлуномид, который в кишечнике и в плазме крови превращается в активный метаболит, который ингибирует дигидрооротат дегидрогеназу, что вызывает торможение синтеза пиримидиновых оснований и прекращение клеточного роста стимулированных клеток в G1-фазе. В результате нарушается пролиферация Т-клеток и выработка антител В-клетками. Лефлуномид при ревматоидном артрите не уступает по эффективности метотрексату. Терифлуномид — активный метаболит лефлуномида. К основным побочным эффектам относятся облысение, диарея, поражение печени и кожи; реже данные препараты провоцируют интерстициальные болезни лёгких, гипертензию, ожирение, лейкопению [5].

Сульфасалазин — соединение сульфаниламида сульфапиридина с 5-аминосалициловой кислотой, вследствие чего обладает двойным противовоспалительным и антибактериальным действием. Он нарушает функцию Т- и В-лимфоцитов, тормозит освобождение воспалительных интерлейкинов и TNF — α, что может привести к ингибированию синтеза иммунных комплексов и ревматоидных факторов, тем самым облегчая иммунопатологические процессы при ревматоидном артрите. Побочные эффекты (тошнота, головная боль, кожные сыпи, реже — нейтропения, гемолитическая анемия, метгемоглобинемия, тромбоцитопения, нарушения функций печени, почек) нередки и из-за этого примерно ¹/₃ пациентов прекращает лечение [5].

Соли золота (препараты золота: ауротималат натрий, ауротиоглюкоза применяются парентерально, ауранофин — внутрь) и пеницилламин (купренил) применяются очень редко из-за высокой токсичности и сравнительно малой эффективности [5].

Биологические базисные противовоспалительные препараты (бБПВП) получены генно-инженерным путём после расшифровки тех или иных звеньев патогенеза РА и широко используются в медицинской практике последние 20 лет. В основном они представлены полипептидными (белковыми) молекулами с различным механизмом действия (табл. 2). В целом их действие более безопасно, селективно и целенаправленно, чем у сБПВП [31].

Ингибиторы TNF- (адалимумаб, инфликсимаб, этанерцепт, цертолизумаб, голимумаб) вследствие высокой эффективности и относительно низкой токсичности являются средствами выбора бБПВП. Комбинация с метотрексатом снижает риск развития антител к этим веществам и, одновременно усиливает их эффективность. Адалимумаб — рекомбинантные человеческие анти-TNF моноклональные антитела; инфликсимаб — это смесь человеческих и мышиных моноклональных антител. Более эффективны при сочетании с метотрексатом, циклоспорином и хинолинами. Цертолизумаб и голимумаб — это рекомбинантные гуманизированные антитела, нейтрализующие мембранный и растворимый TNF-α. Этанерцепт — это рекомбинантная смесь белков (растворимый рецептор), блокирующая молекулы TNF-α и лимфотоксин-α. Он состоит из двух частей внеклеточного домена рецептора TNF-α, соединённого с фрагментом Fc человеческого IgG1р (Fc-рецептор — белок, расположенный на поверхности клеток иммунной системы) [32–34].

В целом, анти-ФНО-α терапия считается достаточно безопасной, но дорогостоящей [8], однако в течение года примерно каждый пятый больной прекращает лечение этими препаратами из-за плохой переносимости или неэффективности [35]. Побочные реакции препаратов разнообразны: из-за снижения функций макрофагов повышается риск активации оппортунистических инфекций; увеличивается риск развития рака кожи (включая меланому), утяжеляется течение хронической сердечной недостаточности, вызываются кожные заболевания, повышается риск язвообразования в ЖКТ, интерстициальной пневмонии, саркоидозоподобного синдрома, лейкопении, тромбоцитопении, панцитопении.

К ингибиторам активации (ко-стимуляции) Т-лимфоцитов относится абатацепт — рекомбинантная смесь белков, включающая в себя Fc-область иммуноглобулина G1, соединённого с внеклеточным доменом CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4). Чтобы активировать Т-клетку и вызвать иммунный ответ, антигенпрезентирующая клетка, должна передать ей два сигнала (ко-стимуляция). Первым сигналом является основной комплекс гистосовместимости в сочетании с антигеном, а другой сигнал представляет собой молекулу CD80 или CD86. Абатацепт связывается с молекулой CD80 и CD86 и предотвращает второй сигнал, без которого Т-клетка не может быть активирована. Основной побочный эффект — повышение риска инфекций верхних дыхательных путей. Не рекомендуется комбинировать его с бБПВП, т. к. возрастает риск тяжёлой инфекции [32].

Из ингибиторов В-лимфоцитов для лечения РА используется только ритуксимаб, который представляет собой химерное моноклональное антитело мыши/человека, которое специфически связывается с трансмембранным антигеном CD20 на В-лимфоцитах и инициирует иммунологические реакции, опосредующие лизис В-клеток. Обладает многообразными побочными эффектами со стороны пищеварительной, нервной, сердечно-сосудистой систем; возможно развитие тяжёлых тромбоцитопении, нейтропении, анемии [32].

Ингибиторы интерлейкинов (IL) — разнородная по происхождению, механизму действия и применению группа лекарственных веществ.

К ингибиторам интерлейкина-6 (IL-6) относятся тоцилизумаб, олокизумаб и сарилумаб [36–39], которые являются гуманизированными антителами («-маб»). Присоединяясь к циркулирующим и мембранным рецепторам IL-6, они блокируют стимуляцию ими воспаления суставов. Тоцилизумаб применяется как монотерапия при непереносимости метотрексата или в комбинации с ним при неэффективности ингибиторов TNF-α. Это единственный бБПВП, превосходящий по эффективности метотрексат [40]. Основное применение препаратов — комбинированная терапия с метотрексатом, при его недостаточно эффективной монотерапии. Побочные эффекты нередки, но обычно нетяжёлые: респираторные инфекции, головная боль, повышения уровня печёночных ферментов и липидов крови, гипертензия.

К ингибиторам интерлейкина-1 (IL-1) относятся анакинра, канакинумаб, рилонацепт. IL-1 — продукт макрофагов, B-лимфоцитов, фибробластов и ряда других клеток, управляет сигнальным путём IL-6 и играет ключевую роль в патогенезе ревматоидного артрита.

Анакинра — рекомбинантная форма естественного антагониста рецепторов IL-1 (IL-1α и IL-1β); канакинумаб (человеческое моноклональное антитело) и рилонацепт (химерное антитело), которые при присоединении к IL-1β блокируют присоединение последнего к собственному рецептору. Их не комбинируют с ингибиторами TNF-α из-за высокого риска нейтропении и тяжёлых инфекций. Побочные эффекты ингибиторов IL-1: местная реакция на инъекции, респираторные инфекции; реже головная боль, боль в суставах, диарея, тошнота и обратимая нейтропения.

Ингибитор Янус-киназ. Семейство ферментов Янус-киназ представлено четырьмя JAK-ферментами (Just Another Kinase): JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2, которые работают в парах, фосфорилируя и активируя сигнальные белки-переносчики и активаторы транскрипции (STAT — Signal Transducer and Activator of Transcription) [41][42]. Процесс фосфорилирования, в свою очередь, модулирует экспрессию генов, что изменяет функции клеток. JAK1 играет важную роль в передаче цитокинами сигналов воспаления, в то время как JAK2 важен для созревания эритроцитов, JAK3 принимает участие в иммунном надзоре и регуляции функции лимфоцитов. Нарушение системы JAK-STAT имеет ключевое значение в аутоиммунных заболеваниях, включая ревматоидный артрит. Янус-киназы регулируют активность ряда цитокинов (включая IL-2, -4, -7, -9, -15 и -21), выполняющих интегрирующую роль в процессах активации лимфоцитов, их пролиферации, функционирования и торможения передачи сигнала, что приводит к модулированию разнообразных аспектов иммунного ответа [43][44]. Многочисленные исследования показали, что сигнальный путь JAK-STAT аномально активируется во время РА [8][41].

Тофацитиниб (окончание «-ниб» означает, что это низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы) и барицитиниб являются обратимыми ингибиторами в той или иной степени всех 4 ферментов (в большей степени JAK3) семейства Янус-киназ. Упадацитиниб является более мощным ингибитором JAK1 по сравнению с JAK2 и JAK3. В медицинскую практику также вошли селективный ингибитор JAK1 филготиниб [45] и ингибитор JAK1/2/3 пефицитиниб [46]. Ингибиторы Янус-киназ нарушают дифференциацию, пролиферацию и функции натуральных киллеров, Т- и В- лимфоцитов и чаще всего применяются для лечения РА, резистентного к метотрексату (в комбинации с ним или как монотерапия). Также их применяют при неэффективности моноклональных антител. Известно, что моноклональное антитело блокирует провоспалительный цитокин, действуя снаружи клетки, препятствуя связыванию цитокина со своим рецептором. Однако при активирующих мутациях Янус-киназ, каскад внутриклеточных реакций может запускаться сам, без участия цитокина. В этом случае будут эффективны ингибиторы Янус-киназ. Побочные реакции: повышение риска инфекции из-за снижения иммунитета, тромбозы, повышение риска развития рака (чаще, чем при применении TNF-α), дислипидемия, нарушения со стороны крови, печени и ЖКТ.

В том случае, если эффект от монотерапии отдельного БПВП недостаточный, то для повышения терапевтического действия используется комбинированная базис-терапия. Условия для комбинирования: а) разный механизм комбинируемых БПВП; б) отсутствие между ними фармакокинетических взаимодействий; в) несовпадающие побочные реакции. Эффект метотрексата усиливается при сочетании с ингибиторами TNF-α, хинолинами, тоцилизумабом (препарат выбора), циклоспорином, ритуксимабом и лефлуномидом. Комбинация метотрексат + сульфасалазин + гидроксихлорохин не уступает комбинации метотрексата + этанерцепт. Не используются комбинации метотрексата с сульфасалазином или с азатиоприном, а также препаратов TNF-α с ингибиторами интерлейкинов.

Лечение ревматоидного артрита является длительным процессом, а лекарственные средства, используемые для его лечения (НПВП, глюкокортикостероиды, метотрексат и другие БПВП) далеко не безопасны и не всегда обладают значимой эффективностью. К их основным побочным эффектам относят иммуносупрессию, язвенную болезнь желудка, остеопороз, диспептические расстройства, усталость, цитопению, сыпь, поражения печени и возможность развития инфекций. Серьёзным недостатком БПВП является их высокая иммуногенность, что ведёт к вторичной неэффективности лечения за счёт образования противолекарственных антител, а также к развитию ГИБП-индуцированных вторичных иммунологических феноменов [28]. В среднем 20–50 % пациентов вынуждены прекращать терапию вследствие отсутствия эффективности либо непереносимость назначенных препаратов [23][46]. Поэтому существует острая необходимость в разработке новых фармакологических мишеней, при воздействии на которые повышалась бы эффективность и снижалась токсичность применяемых лекарств.

Одной из перспективных терапевтических мишеней являются рецепторы, активируемые протеиназами или протеиназа-активированные рецепторы (англ. proteinase-activated receptors; PARs). Они относятся к классу связанных с G-белком рецепторов [47][48]. Определяющей особенностью этих рецепторов является их необратимая активация протеазами. Обнаруженные в 1990-х годах 4 формы PARs: PAR1, PAR2, PAR3 и PAR4, экспрессируются на мембране клеток практически всех органов и систем, и регулируют многочисленные физиологические функции, в том числе сокращение гладкомышечных клеток, чувствительность к боли, высвобождение липидных медиаторов, цитокинов, нейропептидов. Активация PAR также связана с клиническими проявлениями в виде воспаления, отёка, боли [47]. Рецепторы PAR2 экспрессируются в иммунных клетках как врождённой, так и адаптивной иммунной системы и играют немаловажную роль в развитии широкого круга заболеваний [49].

Фактором активации PAR является коагуляционная протеаза FXa — ключевой фактор системы свёртывания крови (приводит к образованию тромбина из протромбина), которая также является ключевым модулятором системного воспалительного ответа посредством активации PAR1, PAR2 и транскрипции NF-kB. Активация PARs индуцирует деградацию I-κB, белка-ингибитора, который препятствует транслокации NF-kB в ядро, чтобы активировать промоторные области многих провоспалительных генов. В частности, этот механизм увеличивает продукцию IL-6, IL-8 и некоторых хемокинов, таких как MCP-1. Экспрессия молекул адгезии, таких как E-селектин, молекул межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) и молекул адгезии сосудистых клеток-1 (VCAM-1) повышается, способствуя миграции лейкоцитов в очаг воспаления. Таким образом, активация PAR2 способствует возникновению воспаления, фиброза и разрастание плотных соединительных тканей, а система PAR-2/FXa является ключевым модулятором системного воспалительного ответа. Её ингибирование препятствует запуску механизма развития патологии [50]. Кроме FXa PAR2, активируется рядом других сериновых протеаз, таких как трипсин, триптаза тучных клеток, нейтрофильная протеиназа 3 и матриптаза, которые образуются и высвобождаются при повреждении и/или воспалении тканей [15][51][52].

Появляется всё больше экспериментальных и клинических доказательств, определяющих ключевую патофизиологическую роль PAR2 в развитии РА [15][53]. Повышение PAR2 отмечено как в моноцитах, макрофагах, фибробластоподобных синовиоцитах, так и в сыворотке пациентов с РА. В исследованиях было продемонстрирована повышенная экспрессия транскрипта и белка PAR2 в синовиальных биоптатах и изолированных фибробластах из синовиальной оболочки у пациентов с РА [54]. Воспалительная роль PAR2 в синовиальной оболочке была подтверждена корреляцией экспрессии PAR2 у пациентов с РА с различной степенью синовиальной патологии [54], а экспрессия PAR2 на моноцитах пациентов коррелирует с классическими биомаркерами обострения заболевания, такими как скорость оседания эритроцитов и уровни С-реактивного белка [15][55]. Также было показано, что секреция IL-1β в синовиальной среде, которая управляет катаболической активностью внутри хондроцитов, также активирует PAR2 [56].

При активации PAR2 высвобождается профрагмент PAR2 (PRO-PAR2) [52], уровень которого значимо повышается у пациентов с РА по сравнению со здоровыми людьми [54]. Причём уровень PRO-PAR2 был значительно повышен у пациентов с РА (системном заболевании), тогда как при остеоартрите его повышение не было статистически значимо. Это позволяет использовать определение уровня PRO-PAR2 в сыворотке крови как чувствительный и точный биомаркер для ранней диагностики и мониторинга лечения РА, т. к. он модулируется противовоспалительным лечением [52].

Таким образом, систему PAR2 можно считать перспективной диагностической и терапевтической мишенью при лечении РА [15][57]. Ингибирование PAR2 должно препятствовать развитию патогенеза РА, способно положительно модифицировать течение заболевания и будет способствовать ослаблению воспалительных процессов и сопутствующих им болевых ощущений [15][58]. Проведённые эксперименты на лабораторных животных подтверждают данный тезис. Было показано, что блокада PAR2 снижает выработку провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, IL-8, IL-17, IFN-γ, TNF-α, экспрессию матриксной металлопротеиназы-2 (ММП-2) и матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9), а также значительно снижалось количество антител против коллагена типа II [56].

Поиск лекарственных средств, ингибирующих PAR2, активно идёт последнее десятилетие. Основные его направления следующие: косвенная блокада активности; создание моноклональных антител; поиск среди пептидных соединений; синтез низкомолекулярных веществ.

Косвенная блокада активности PAR2. Связь между секрецией PAR2 и IL-6 указывает на то, что PAR2 индуцирует секрецию IL-6 макрофагами и Т-клетками [55, 56]. Предполагается, что PAR2 является вышестоящим регулятором секреции IL-6, и блокада IL-6 может косвенно подавлять PAR2-активирующие протеиназы, и, таким образом, снижать его уровни [59]. Механизм этого процесса связан с тем, что IL-6 способствует переходу нейтрофилов в моноциты, которые, в свою очередь, выделяют протеазы активации PAR2 [59][60].

Так, уровни PRO-PAR2 (маркер активности системы PAR2) в сыворотке измерялись у пациентов с РА, получавших метотрексат и тоцилизумаб, и сравнивались с пациентами, получавшими только метотрексат. Тоцилизумаб блокировал воспалительные реакции, ингибируя активацию рецептора IL-6, что косвенно приводит к снижению активации PAR2 воспалительными протеазами [52].

Моноклональные антитела. Принцип действия моноклональных антител на PAR2 заключается в связывании с рецепторами, блокировании протеолитического расщепления и предотвращении активации. Возможно их использование в комбинации с другими препаратами для лечения РА с целью усиления терапевтического эффекта.

С помощью библиотеки фагового дисплея HuCAL GOLD^® были созданы полностью человеческие антитела, специфически блокирующие сайт протеазного расщепления в N-концевом домене PAR2 [49]. Оптимизация аффинности in vitro привела к получению антител с улучшенной аффинностью до 1000 раз по сравнению с исходными родительскими антителами и с константами диссоциации всего 100 пМ. Антитела эффективно ингибировали опосредованное PAR2 внутриклеточное высвобождение кальция и секрецию цитокинов в различных типах клеток, стимулированных трипсином. Кроме того, антитела продемонстрировали мощное ингибирование индуцированной трипсином релаксации изолированных колец аорты крысы.

Из опубликованных материалов наибольший интерес представляют два in vivo исследования нескольких моноклональных антител на каррагинан/каолин-индуцированной модели артрита у крыс [61]. Также в двух исследованиях на мышиной модели лечения воспаления суставов с помощью анти-PAR2-специфических моноклональных антител SAM-11 было показано достоверное ингибирование воспалительного отёка [49]. В 2020 году начались исследования моноклональных антител PAR2 на людях. Препарат MEDI0618 был включён в I фазу клинических испытаний при остеоартрите [62].

Пептиды. Первые синтетические пептидные PAR2-антагонисты были разработаны с учётом естественной аминокислотной последовательности аминоконцевой части PAR2. На базе рецепторов человека был получен пептид SLIGKV-NH2, а мыши — SLIGRL-NH2, которые были способны взаимодействовать с PAR2, препятствуя его активации естественными лигандами (то есть действовали как классические рецепторные блокаторы). Их применение на фоне экспериментального артрита у животных препятствовало развитию отёка лапы у крыс и предотвращало активацию тучных клеток и нейтрофилов [63]. Другой пептидный PAR2-антагонист FSLLRY-NH2 [48] в культуре клеток HepG2 снижал уровень провоспалительных цитокинов IL-8, IL-1β и TNF-α, индуцированных введением H₂O₂.

И если крупномолекулярные пептидные антагонисты PAR2 представляют лишь теоретический интерес, то гексапептид GB88, обратимо ингибирующий активацию PAR2 как эндогенными лигандами (трипсин, триптаза), так и синтетическими пептидами (2f-LIGRLO-NH2) и непептидными веществами (GB110), является перспективным соединением для дальнейших исследований [64].

Низкомолекулярные антагонисты PAR2. В качестве лекарственных препаратов в терапии РА наиболее целесообразно использование низкомолекулярных антагонистов PAR2, так они в отличие от пептидных, более стабильны in vivo и обладают лучшим фармакокинетическим профилем и биодоступностью [58].

Изучение кристаллических структур PAR2 выявило две основные точки связывания лекарств с рецептором: аллостерический сайт, связывающийся с пептидными активаторами рецептора (пептид-связывающий домен рецептора), и ортостерический сайт, реагирующий в большей степени на протеазную активацию (протеаза-активируемый домен рецептора) [62]. На основании этого были разработаны конкурентный ингибитор, который связывается с ортостерическим сайтом, и отрицательный аллостерический модулятор, который связывается с удалённым сайтом. В первом случае препарат фиксируется в окклюзированном кармане, состоящем из трансмембранных спиралей 1–3, 7 и внеклеточной петли 2, тогда как второе соединение занимает карман, обращённый к липидному бислою и образованный трансмембранными спиралями 2, 3 и 4 [63]. Важно отметить, что, несмотря, на разные механизмы блокирования активности PAR2, оба антагониста могут ингибировать как зависимые, так и независимые от G-белка пути внутриклеточной активации (в частности, высвобождения Са²⁺) и оказывать противовоспалительное действие у крыс при моделировании у них коллаген-индуцированного артрита или артрита с помощью пептидного агониста PAR2 [63–65].

Все современные низкомолекулярные антагонисты PAR2 относятся к гетероциклическим соединениям, наиболее перспективные из которых являются производные пиперазина, пиперидина, хиназолина, бензимидазола, изоксазола, амидина, бензотиазол-карбоксамида и имидазолпиридазина [63, 64]. Опубликован ряд патентов (WO 2014020351 А1, WO 2014020350 А1, ЕР 1806141 A1, US 20090012263 A1, US 20060063930 A1, US 20020103138 A1), где высокоактивные антагонисты PAR2 — низкомолекулярные органические соединения — предложены в качестве эффективного средства для терапии РА [66][67].

Заключение / Conclusion

Исследования антагонистов PAR2 продолжаются в ряде стран, включая и Россию [68], что позволяет надеяться, что в ближайшие годы данные лекарственные средства могут появится в арсенале врача.